應用案例（質量光度計-MP）：質量光度計測量蛋白質的變性

Characterization of protein interaction equilibria

翻譯整理：北京佰司特科技有限責任公司

質量光度計量化了溶液中生物分子的質量分布。在自然條件下，已確定其用于分析生物樣品的純度、完整性和功能。然而，其在變性條件下的性能尚未得到*評估。在本申請說明中，我們證明質量光度計是研究低聚物蛋白質變性（去折疊）和復性（再折疊）的有用工具。通過化學變性破壞蛋白質的天然結構可以深入了解蛋白質和復合物的結構和穩定性。尿素和鹽酸胍（GdnHCI）等化學變性劑通過改變蛋白質疏水殘基暴露于周圍水溶液中，促進蛋白質的變性（去折疊）。雖然化學變性在生物化學研究中已經用了幾十年，但由于其涉及大量分析技術，操作成本高，靈敏度低，數據分析和解釋太復雜，因此對變性（去折疊）和復性（再折疊）的監測仍然具有挑戰性。

在本應用說明中，我們探討了質量光度計（MP）的功能，以快速獲得有關蛋白質去變性（去折疊）和復性（再折疊）的直觀結果。與所有MP應用一樣，測量過程只需極少量樣品，就可以方便地測試各種變性條件。為了舉例說明MP在非折疊/復性實驗中的優勢和局限性，我們對烯醇化酶進行了研究，這是一種已知可進行可逆變性的蛋白質。

質量光度計對結構不敏感

MP是一種超靈敏的單分子顯微鏡技術，用于檢測玻璃-水界面溶液中蛋白質（或其他生物分子）的散射信號。落在該界面上的粒子散射的光量取決于粒子的質量，而不是其形狀。無論蛋白質是折疊的還是未折疊的，其質量都保持不變，MP讀數也保持不變。

我們在天然和變性條件下對烯醇化酶的MP測量表明MP對蛋白質折疊狀態不敏感。在自然條件下，烯醇化酶主要形成約93 kDa質量的二聚體和一些約46 kDa質量的單體。在變性條件下（尿素），二聚體分離成大部分未折疊的單體。然而，正如預期的那樣，未折疊單體的質量（通過MP測量（?46 kDa））與折疊單體的質量相同（圖1）。MP對折疊狀態的不敏感使其成為監測折疊相關寡聚的可行方法。

高濃度變性劑會影響光學測量

蛋白質去折疊實驗通常在非常高濃度的變性劑下進行。然而，當尿素和GdnHCI在水溶液中濃度較高時，會形成氫鍵聚集。這種團簇可以用MP觀察到，因為聚集體的光學性質不同于周圍溶液的光學性質。這種差異導致背景光散射，在比率MP圖像中表現為圖案（圖2）。隨著尿素濃度的增加，圖案及其相應的信號也增加，直到濃度超過1M尿素時達到平臺（圖2）。

來自聚集體的圖案信號表示背景噪聲，這將使使用MP測量生物分子的質量更加困難。MP測量的散射信號甚至可能不再是可量化的，尤其是對于接近探測下限的較小物體。因此，在使用變性劑時，檢查背景信號非常重要，這將為實驗設置噪聲基線。以下章節描述了如何使用稀釋去除變性劑背景信號。

質量光度計揭示復性動力學

當變性劑背景被稀釋時，MP可以對變性過程提供有價值的分析，從而可以監測低聚蛋白質的復性動力學。烯醇化酶在自然條件下主要是二聚體，在變性條件下24小時后幾乎*是單體。當變性烯醇化酶樣品通過PBS稀釋回到接近自然條件時，MP質量分布圖捕捉到了這種變化（圖3）。稀釋后立即進行第一次測量，這得益于MP的快速性及其在寬質量范圍內準確執行的能力。

我們還能夠使用MP監測變性烯醇化酶樣品的復性動力學，顯示二聚體在稀釋后的最初60分鐘內逐漸重新形成（圖3）。二聚體回復動力學可以通過繪制單體/二聚體比率隨時間的函數來可視化。回收率取決于所使用的變性物質，用GdnHCI變性的烯醇化酶恢復得更快（圖4）。回復過程提供了有關蛋白質相互作用以及不同變性物質如何影響蛋白質相互作用的重要信息。

這項研究表明，即使在未折疊狀態下，MP也能提供有關生物分子和復合物的質量和組成的寶貴信息。MP提供了一種簡單的方法來監測多聚體復合物中蛋白質的變性和復性過程，并很容易比較變性劑的效果。