梯度PCR儀常見(jiàn)問(wèn)題的主要解決方案分享

　　梯度PCR儀常見(jiàn)問(wèn)題的主要解決方案：

　　1.梯度PCR儀在產(chǎn)物序列中引入了錯(cuò)誤

　　這是由于聚合酶忠實(shí)性低或者循環(huán)數(shù)太多，這時(shí)需要使用帶有校正活性的熱穩(wěn)定聚合酶，同時(shí)降低循環(huán)數(shù)。此外，四種dNTP的濃度不同也會(huì)出現(xiàn)該問(wèn)題，此時(shí)應(yīng)制備新的濃度相同的dNTP混合物。

　　2.PCR跑膠

　　該現(xiàn)象表現(xiàn)為目的條帶很亮，但是邊沿不清楚，前后有拖尾現(xiàn)象。出現(xiàn)這樣的問(wèn)題，則需要進(jìn)行細(xì)致的分析，因?yàn)橐鹪搯?wèn)題的可能很多。可先檢查是否模板質(zhì)量問(wèn)題，如有降解等，模板應(yīng)避免反復(fù)凍融。也有可能是抽提RNA時(shí)有污染，則需要重新抽提RNA。此外，也可能是非特異性擴(kuò)增引發(fā)該問(wèn)題，可提高退火溫度，少循環(huán)次數(shù)。電泳緩沖液時(shí)間太長(zhǎng)，ph值和鹽離子濃度明顯改變、電泳時(shí)電壓太高、電泳液過(guò)久沒(méi)換，電泳膠臟了等都可能引發(fā)該問(wèn)題。如果不是由上述原因引起，則進(jìn)一步檢查加樣量是否過(guò)大，制膠過(guò)程中膠孔是否制好，EB是否沖洗干凈、模板中是否混有基因組DNA或蛋白等。也需考慮是否擴(kuò)增的條件不合適。針對(duì)具體原因再采取相應(yīng)的措施。

　　3.對(duì)梯度PCR儀產(chǎn)物需要用凝膠純化的時(shí)間掌控

　　當(dāng)凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶時(shí)，則無(wú)需使用凝膠純化；

　　當(dāng)可見(jiàn)其他雜帶時(shí)，則可能是積累了大量引物的二聚體，在克隆前需要做凝膠純化。